細胞凍存程序儀，細胞保存操作步驟

   在細胞培養檢測實驗在實驗儀器、培養基等等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發明了細胞保存這個實驗步驟，將暫時多出來的細胞冰凍保存，以最大程度保存細胞活力。
一、細胞冷凍保存
1.  材料：
生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO (Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene　5000-0020)、0.  4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數盤與蓋玻片、細胞凍存程序儀(也稱為程序降溫儀，品牌上海田楓)
2.  冷凍保存方法：
(1)傳統方法: 冷存管置于4 ℃10分鐘--->-20 ℃30分鐘--->-80 ℃ 16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。
-20 ℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫：利用已設定程序的等速細胞凍存程序儀以-1～-3 ℃/分鐘之速度由室溫降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
3.  步驟：
(1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
(3)離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0.  1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液(DMSO最后濃度為5～10%)，使細胞濃度為1～5×106cells/ ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1～2 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。

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